高效液相色譜儀原理及操作步驟和注意事項【圖文】

高效液相色譜儀是是一種基于經(jīng)典液相色譜法，結(jié)合氣相色譜理論和實驗技術(shù)的新型液相色譜分析法，廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境檢測、食品安全及生化研究等領(lǐng)域。其核心原理是通過高壓驅(qū)動流動相攜帶樣品通過固定相色譜柱，利用各組分在兩相間分配系數(shù)的差異實現(xiàn)分離，并由檢測器定量分析。依利特為您整理HPLC的工作原理、標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟及使用注意事項，確保實驗的準(zhǔn)確性與儀器的高效運行。

高效液相色譜原理

高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

高效液相色譜儀操作工序：

一：配置好實驗所需的流動相(甲醇:水=8:2)和純甲醇，經(jīng)過濾超聲后備用。

二：打開泵電源。將泵的壓力上限設(shè)置為40MPa。(已設(shè)定好，可不用再設(shè)定)

1.將泵的過濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，設(shè)置流量為1ml,然后按“啟動/停止”鍵開始走液，經(jīng)過10-20分鐘后按“啟動/停止”鍵停止走液。

2.將泵的過濾頭輕輕放入到新配好的甲醇水中，然后按“啟動/停止”鍵開始走液。

3.打開檢測器電源，調(diào)整好檢測器的波長280(已設(shè)定好，可不用再設(shè)定)，然后按“調(diào)零”鍵調(diào)零。

三：打開電腦上的UC-3268色譜工作站，左上方出現(xiàn)握手圖標(biāo)，說明工作站已連接儀器。然后查看基線等基線走直即可進(jìn)樣。

四：進(jìn)樣之前先看基線在不在界面內(nèi)，如果不在按“調(diào)零”鍵調(diào)零，之后再開始進(jìn)標(biāo)樣，將液體進(jìn)樣閥扳到“LOAD”位置，將標(biāo)樣打入液體進(jìn)樣閥內(nèi)，再把液體進(jìn)樣閥扳到“INJECT”位置,此時工作站已啟動，等峰出完后點“停止”鍵。

五:做校正曲線

1.編輯定量參數(shù)點擊“定量參數(shù)”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口：設(shè)置好“定量方式：（峰面積）”、“定量方法（外標(biāo)法）”、“標(biāo)準(zhǔn)（1個濃度標(biāo)樣，選‘1點’”）、“次方（1次）”、“標(biāo)樣濃度單位（%）”、“樣品結(jié)果單位（%）”。

2.填寫組份表

點擊“組份表”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口，填入所分析的樣品組份名稱（辣椒素）、保留時間（5.2分鐘左右）及標(biāo)準(zhǔn)濃度（100）。

3.定義校正曲線

點擊“校正曲線”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口。定義各點對應(yīng)的色譜峰文件。即先用鼠標(biāo)指向標(biāo)樣點號，然后單擊左鍵，則該點號被藍(lán)框覆蓋，再單擊右鍵，彈出右鍵可選菜單：

選擇“增加”項（此項操作即表示同一個濃度點，可以加入幾個平行實驗的數(shù)據(jù)進(jìn)來進(jìn)行平均計算），彈出“譜圖選擇”窗口。然后在此選擇相應(yīng)的譜圖文件，則該序號點的文件前出現(xiàn)一個“+”號。各個點定義完成后，單擊“重校正”即可顯示出校正曲線。點“確認(rèn)”鍵。

六:進(jìn)樣品，出完峰后點停止，點屏幕報告即可查看結(jié)果。如有多個樣品，可重復(fù) 進(jìn)樣品 此步驟即可。

七:查看以前樣品結(jié)果

進(jìn)入“再處理”界面，點擊“打開數(shù)據(jù)文件”圖標(biāo)，彈出“譜圖選擇”窗口在此選擇樣品譜圖文件，如下：

然后要單擊“重新計算”按鈕，再點擊“屏幕報告”圖標(biāo)，即可看到屏幕報告表：

八:關(guān)機(jī)

關(guān)閉檢測器電源，按“啟動/停止”鍵停止泵運行，將泵的過濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，按“啟動/停止”鍵開始走液，經(jīng)過10-20分鐘，泵壓力穩(wěn)定后，按“啟動/停止”鍵停止走液，關(guān)閉泵電源。電腦不用可提前關(guān)閉。

液相色譜儀結(jié)構(gòu):

1、溶劑輸送系統(tǒng)；儲液器，用來貯存數(shù)量足夠、符合要求的流動相。配有溶劑過濾器，以防止流動相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣器，脫氣的目的是為了防止流動相從色譜柱內(nèi)流出時釋放出氣泡進(jìn)入檢測器，從而引起噪聲，不能正常檢測。

輸液泵，將儲液器中的流動相連續(xù)不斷地以高壓形式進(jìn)入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。梯度洗脫裝置，是在分離過程中通過逐漸改變流動相的組成增加洗脫能力的一種裝置。

2、進(jìn)樣系統(tǒng)；進(jìn)樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進(jìn)樣方式可以分為兩種：閥進(jìn)樣或自動進(jìn)樣。比較常用的是采用自動進(jìn)樣器裝樣。

3、分離系統(tǒng)；色譜柱：對樣品進(jìn)行分離，是整個色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量優(yōu)劣直接影響到分離的效果。

4、檢測系統(tǒng)；檢測器：將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號，被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收，得到樣品分離的色譜圖。

5、數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)；對色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并參與HPLC儀器的自動控制。

液相色譜儀注意事項：

1、泵正常工作時，在流動相和流速不變的前提下柱壓應(yīng)該是穩(wěn)定的，當(dāng)然在換流動相時壓力變化是正常的，正常情況下如果柱壓升高基本上都是由色譜柱使用時間長引起的（只有更換色譜柱），如果正常情況下壓力突然降低有可能是（1）接頭處有漏液的地方，采取的方法是有濾紙檢查，如有漏液的地方用扳手?jǐn)Q緊即可。如果沒有漏液則可能是（2）白色的管子里面有氣泡從而導(dǎo)致流動相進(jìn)不到泵里面去，采取的方法是排氣泡。排氣時:先STOP停泵--打開排氣閥--按PURGE（快沖）鍵--等氣泡排完后先STOP停泵--擰緊排氣閥，其先后步驟不要搞反了。

2、泵正常工作時最高壓力最好不要超過200KG，所以打開泵以后可以將泵的zui大壓力調(diào)到200KG，這樣如果壓力超過上限則會自動報警停機(jī)，流速zui好不用超過1ML/MIN，如果使用時壓力超過200KG，建議將流速調(diào)低點以降低壓力（在色譜柱正常的情況下），如果是因為色譜柱長時間使用造成壓力升高則建議更換色譜柱（因為色譜柱屬于耗材長時間使用就需要更換，更換的主要依據(jù)色譜柱出峰不正?；蛘咧鶋毫^高）。

3、泵正常工作時平均每15天左右向注油孔加潤滑油2-3滴。

4、流動相里面如果有鹽或酸類，做完實驗后要先用95%二次蒸餾水與5%甲醇洗色譜柱40分鐘左右，然后用純甲醇洗30分鐘左右才可以關(guān)機(jī)。第二天如果繼續(xù)做實驗流動相里面仍舊有鹽或酸類，zui好先用95%二次蒸餾水與5%甲醇過渡20分鐘，再用流動相。如果流動相里面只有甲醇，水，乙腈，做完實驗后就不用95%二次蒸餾水5%甲醇沖洗，可直接用純甲醇洗30分鐘即可關(guān)機(jī)。

5、色譜柱的耐酸PH值范圍3-8使用時不要超出。

6、儀器長期不用時一定要將濾頭泡在甲醇里半月開機(jī)一次，如果開機(jī)時泵抽不上液可以打開排氣閥按PURGE快沖。

7、調(diào)反壓器時要注意等液體流出來以后才能調(diào)，一般調(diào)8--10KG，比如現(xiàn)在泵顯示屏顯示柱壓50KG那再增加10KG顯示屏上顯示柱壓60KG然后擰緊鎖緊螺母。

8、關(guān)機(jī)順序：清洗液路時可以把檢測器直接關(guān)機(jī)，清洗結(jié)束后先按STOP讓泵停止后再關(guān)電源，不允許直接關(guān)機(jī)

依利特30年來始終專注于色譜技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，構(gòu)建了涵蓋“實驗室理化分析、新興生物技術(shù)上游純化、臨床分析檢測”三位一體的業(yè)務(wù)布局。其產(chǎn)品線廣泛覆蓋實驗室分析、生物制藥純化及臨床檢測等領(lǐng)域，包括1100/3100/3200/3200L系列高效液相色譜儀、色譜工作站軟件、MS2 Vertical 9100三重四極桿質(zhì)譜儀、氣相色譜儀、制備純化色譜系統(tǒng)、計量泵、色譜柱及其配件等核心產(chǎn)品。經(jīng)過三十年的技術(shù)積累，公司持續(xù)深化色譜技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用，推動分析檢測與純化技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展。